Mutacja w genie kodującym stymulujące białko G cyklazy adenylanowej w dziedzicznym osteodystrofii Albrighta cd

Miernik gs. messenger (mRNA) mierzono jako funkcję całkowitego RNA naniesionego na żel i jako funkcję intensywności hybrydyzacji mRNA .-aktyny.28, 30 Do analizy genomowego DNA wykorzystano endonukleazy restrykcyjne zakupione w Bethesda Research Laboratories (Gaithersburg, MD) lub New England Biolabs (Beverly, Mass.) I postępowaliśmy zgodnie ze wskazówkami producenta. Każdą próbkę DNA (5 do 10 .g) trawiono nadmiarem różnych enzymów restrykcyjnych przez 15 godzin, wielkość frakcjonowano przez elektroforezę na żelu agarozowym i przeniesiono na membrany GeneScreen Plus. Bloty RNA i DNA hybrydyzowano z opisanymi radioaktywnie sondami DNA, jak opisano wcześniej [28, 30]
Sondy do hybrydyzacji DNA
Plazmid Pv-1, zawierający sekwencję genomowego DNA o długości 1,2 kb składającą się z regionu flankującego 5 ludzkiego genu Gs., jak również pierwszego 80 pz eksonu 1, został hojnie dostarczony przez Dr. Yoshito Kaziro (Institute of Medical Science, University of Tokyo) .31 Plazmid pHGS-8, zawierający sekwencję pełnej długości (1,8 kb) ludzkiego ludzkiego mysiego GRS., był hojnie dostarczony przez dr Arthura Levinsona (Genentech, San Francisco). Fragment Ncol-SalI o długości 1,5 kb zawierający pełne kodowanie i nieulegające translacji regiony 3 zastosowano jako sondę do analizy mRNA Gs.. Plazmid pHF.A-1, zawierający pełnej długości komplementarny DNA ludzkiej cytoplazmatycznej .-aktyny, 32 otrzymano od Dr. L. Kedes (Stanford University School of Medicine, Palo Alto, CA). Sondy były znakowane radioaktywnie przez losowy starter33 z [.-32P] dCTP.
Analiza Immunoblot
Szczegóły analizy immunoblotowej błon erytrocytów opisano gdzie indziej.34 W skrócie, białka erytrocytów-błon (50 do 100 .g białka) rozdzielono przez elektroforezę w żelu z dodecylosiarczanem-poliakryloamidem w warunkach redukujących, w których 11% żele z niski procent bis-akryloamidu zastosowano do poprawy rozdzielczości w regionie G.. Białka przenoszono elektroforetycznie z żelu na membrany z difluorku poliwinylidenu (Immobilon, Millipore, Milford, MA) i przeprowadzono immunodetekcję, jak opisano wcześniej.34 Pierwotne antyserum do specyficznych podjednostek białka G podniesiono u królików przeciwko syntetycznym peptydom odpowiadającym zdefiniowanym regiony podjednostek białka G (hojnie dostarczone przez dr Janet Robishaw, Geisinger Clinic, Danville, PA). Surowce odpornościowe C583 i C584, które wytworzono przeciwko syntetycznemu peptydowi na końcu karboksylowym Gs. (CTPEPGEDPRVTRAKY, aminokwasy 325 do 339 egzonu 12) i surowicy odpornościowej A572, która została wytworzona przeciwko peptydowi na końcu aminowym Gs. (CKQLQRDRQVYRATHR, aminokwasy 28 do 42 egzonu 1), rozpoznają formy 45-kd i 52-kd Gs..35. Przeciwciało A569, które rozpoznaje Gs., Gi.-1, Gi.-2, Gi.-3 i Go., zostało podniesione przeciwko syntetycznemu peptydowi. (CGAGESGKSTIVKQMK) wspólny dla podjednostek . Gs, Gi i Go (aminokwasy 47 do 61 eksonu 2) .35 Antiserum GC4, który rozpoznaje zarówno formy 35-kd, jak i 36-kd podjednostki ., został podniesiony przeciwko syntetyczny peptyd (CKTREGNVRVSREL) odpowiadający sekwencjom aminokwasowym powszechnym dla podjednostek .35 i .36 (aminokwasy 127 do 139) .34 W rozcieńczeniu 1: 1000 zastosowano surowice odpornościowe.
Każdy immunoblot inkubowano ze stężeniem wysycającym odpowiedniej surowicy odpornościowej i wiązanie przeciwciała wykrywano przez następną inkubację z białkiem A wyznakowanym 125I i autoradiografią.
[patrz też: powiększone ślinianki, pronacja supinacja, toxoplazmoza objawy ]