Mutacja w genie kodującym stymulujące białko G cyklazy adenylanowej w dziedzicznym osteodystrofii Albrighta ad

W tym badaniu zdefiniowaliśmy nieprawidłowość molekularną w genie kodującym strukturalne nieprawidłowe białko Gs. u dwóch pacjentów z dziedziczną osteodystrofią Albrighta, stosując modyfikację reakcji łańcuchowej polimerazy w celu amplifikacji regionu genu Gs.. Metody
Przedmioty
Rycina 1. Rycina 1. Analiza rodowodów i Southern Blot u pacjenta z dziedziczną osteodystrofią Albrighta. Genomowy DNA strawiono Ncol i hybrydyzowano z fragmentem EcoRI-Xhol 0,86 kb z sondy 5 genomowego Gs., jak opisano w Methods. Nieprawidłowy wzorzec fragmentów restrykcyjnych występował u pacjenta (proband, oznaczony jako II-2) i jego matka (pacjent I-2); fragment 1,5-kb był obecny oprócz oczekiwanego fragmentu 1,0-kb. Fragment o długości 1,5 kb nie był obecny w rodzeństwie pacjenta ani u 19 osób zdrowych (dane nieukazane). Fragment 0,5-kb przewidywany na mapie fragmentów restrykcyjnych Ncol nie został wykryty za pomocą sondy. Aktywność biologiczna Gs. błony komórkowej erytrocytów (wyrażona jako procent średniej wartości w błonach kontrolnych) jest pokazana pod symbolami rodowodu; poziom aktywności nie został określony (raczej w ND). Matka miała dziedziczną dystrofię Albrighta, ale nie miała odporności na hormony (oznaczona jako półstały symbol). Mapa Ncol normalnego genu Gs., zmutowany gen dziedzicznej osteodystrofii Albrighta i granice 5 genomowej sondy Gs. są przedstawione na dole figury. Exon jest reprezentowany przez pełny pasek, a intron przez kreskowany pasek.
Badaliśmy trzech członków rodziny z dziedziczną osteodystrofią Albrighta (ryc. 1). Proband (pacjent II-2), 6 1/2 roku chłopiec z pseudohypopasmatycznością typu Ia i ciężką astmą, urodził się po normalnej ciąży i porodzie. Był dobrze do wieku sześciu miesięcy, kiedy na podstawie klasycznych cech dziedzicznej osteodystrofii Albrighta, pierwotnej niedoczynności tarczycy i podwyższonego poziomu parathormonu w osoczu, dostał diagnozę pseudohipoproteinizmu. Aktywność biologiczna Gs. w jego błonach erytrocytów wynosiła 54% normy. Jego matka (pacjent I-2) miała pseudopseudohipoparakterię i klasyczne cechy dziedzicznej osteodystrofii Albrighta; miała 27 lat i normalną inteligencję, a jej poziomy wapnia, fosforu i parathormonu w osoczu były prawidłowe. Miała prawidłowe wydalanie cyklicznego AMP w moczu w odpowiedzi na wlew wyciągu z przytarczycy bydlęcej (250 U, Parathormone, Eli Lilly, Indianapolis) .25 Aktywność biologiczna Gs. w jej błonach erytrocytarnych wynosiła 57 procent normy. Starszy brat probanda (II-1 na ryc. 1) miał prawidłowe wyniki w ocenie klinicznej i biochemicznej, a aktywność biologiczna jego błon erytrocytarnych wynosiła 100% normy.
Zbadano również siedmiu dodatkowych, niepowiązanych pacjentów z dziedziczną osteodystrofią Albrighta i niedoborem Gs.. Szczegółowe badania endokrynologiczne wielu z tych pacjentów opisano wcześniej. 20, 22, 26 Grupa kontrolna w tych badaniach składała się z 19 zdrowych osób. Aktywność biologiczną Gs. określono za pomocą testu komplementacji266 w oparciu o zdolność solubilizowanych ekstraktów z błon erytrocytarnych do odtworzenia reaktywności cyklazy adenylanowej w błonach otrzymanych z komórek chłoniaka scyklinowego S49, którym genetycznie brakuje białka Gs..
Uzyskano świadomą zgodę na te badania dla każdego przedmiotu zatwierdzonego przez Wspólny Komitet ds. Badań Klinicznych Uniwersytetu Medycyny Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa.
Przygotowanie i analiza DNA i RNA
Genomowe DNA o wysokiej masie cząsteczkowej ekstrahowano z leukocytów krwi obwodowej lub z hodowanych fibroblastów.28 Hodowane linie komórkowe fibroblastów ustalono i utrzymywano w sposób opisany powyżej. 26 Całkowity komórkowy RNA izolowano z konfluentnych monowarstwowych hodowli fibroblastów za pomocą izotiocyjanianu guanidyniowego-chlorku cezu. technika. 29 W celu analizy RNA, zdenaturowano 10 .g RNA, frakcjonowano rozmiar przez elektroforezę w żelu agarozowym zawierającym 2,2 M formaldehydu, 30 i przeniesiono na membrany nylonowe (GeneScreen Plus, Dupont, Wilmington, Del.).
[hasła pokrewne: ropień brodiego, jak zwiększyć fps w minecraft, pełzakowica ]