Mutacja w genie kodującym stymulujące białko G cyklazy adenylanowej w dziedzicznym osteodystrofii Albrighta ad 7

Strzałki wskazują na obecność oczekiwanej zasady nukleotydowej, adeniny, w normalnym allelu i przejście z A-to-G (adenina-do-guanina) w zmutowanym allelu. Oba prążki mają w przybliżeniu taką samą intensywność na autoradiogramie. Ta sama heterozygotyczna mutacja była obecna u matki pacjenta (dane nie przedstawione), co jest zgodne z autosomalnym dominującym modelem dziedziczenia. Analiza intensywności hybrydyzacji fragmentów genu Gs. o wielkości 1,0 kb wytwarzanych przez trawienie Ncol wykazała, że intensywności sygnałów pasm obecnych w DNA od dwóch pacjentów były o połowę mniejsze w podobnych ilościach DNA od normalnych osobników. Podsumowując, obserwacje te sugerują, że pacjenci mieli jeden prawidłowy allel Gs. i jeden wariant allelu Gs.. Zatem, fragment 1,5-kb reprezentuje fragment fuzyjny, który wynika z utraty miejsca egzon Ncol w zmutowanym allelu Gs. (Fig. 1). Aby zdefiniować podstawę molekularną tej mutacji, wykorzystaliśmy reakcję łańcuchową polimerazy i startery oligonukleotydowe DV 157 i MAL-2, które flankują miejsce NcoI w eksonie 1, w celu powielenia segmentu o przewidywanej wielkości (260 bp) z DNA dwóch pacjentów i osób zdrowych (ryc. 5A i 5B). Obecność docelowej sekwencji genu Gs. w obrębie amplifikowanego fragmentu DNA o wielkości 260 pz potwierdzono przez analizę hybrydyzacji metodą blot z sondą oligonukleotydową wyznakowaną radioaktywnie (MAL-3) zawierającą sekwencję wewnętrzną do sekwencji użytej do zalania reakcji łańcuchowej polimerazy (Fig. 5C). Zarówno w przypadku probanda z pseudohypopasminowością typu Ia, jak i jego matki z pseudopseudohipopotomią, analiza sekwencji zamplifikowanego fragmentu (ryc. 6) ujawniła przejście A-do-G w pozycji + jednego allelu genu Gs., który zmienia inicjator metioniny kodon (ATG) do kodonu waliny (GTG). To zastąpienie jednej zasady powoduje utratę miejsca Ncol (CCATGG) w eksonie dotkniętego allelu. Jak przewidywano na podstawie analizy enzymów restrykcyjnych DNA od dwóch pacjentów, jeden allel genu Gs. zawierał normalny nukleotyd adeninowy w pozycji + (ryc. 6).
Dyskusja
Przebadaliśmy dwóch pacjentów z dziedziczną osteodystrofią Albrighta, u których błony erytrocytów zawierały nieprawidłowe białko Gs., które nie wykazywało immunoaktywności z dwoma preparatami przeciwciał specyficznymi dla terminali aminowych. Opracowaliśmy plan zlokalizowania defektu, przewidując, że mutacja zostanie znaleziona w obrębie lub w pobliżu regionów genu Gs., które kodują epitopy, które wiążą te przeciwciała (tj. Eksony i 2). Wynik analizy Southern blot DNA od dwóch pacjentów był zgodny z heterozygotyczną utratą miejsca restrykcyjnego Ncol znajdującego się w eksonie genu Gs.. Po amplifikacji z reakcją łańcuchową polimerazy i bezpośrednim sekwencjonowaniem wybranego fragmentu genu, zidentyfikowaliśmy mutację punktową – tj. ATG . GTG – w kodonie inicjacyjnym jednego allelu Gs. u obu pacjentów, który znosi miejsce restrykcyjne dla Ncol (CCATGG). . CCGTGG).
Podstawienie nukleotydów w uszkodzonym genie Gs. można łatwo zidentyfikować przez utratę miejsca restrykcyjnego Ncol przy użyciu analizy Southern blot. Dlatego użyliśmy NcoI do strawienia genomowego DNA od siedmiu dodatkowych niespokrewnionych pacjentów z dziedziczną osteodystrofią Albrighta i niedoborem Gs. i wykonaliśmy Southern blotting
[przypisy: duomox angina, obturacja płuc, ebola jak można się zarazić ]